Figlio di Giovanni, già ambasciatore a Roma, Francesco era stato avviato alla carriera ecclesiastica. Alla morte del padre nel 1611 smise la veste talare e alcuni anni dopo, nel 1618, prese in moglie Caterina di Francesco Riccardi. Fu eletto ambasciatore a Roma il 15 aprile del 1621 e vi rimase fino al 1643. Tornato in patria fu nominato gentiluomo di Corte di Ferdinando II (1610-1670) e nel 1647 divenne Gran Cancelliere dell'Ordine di Santo Stefano.

Il Niccolini aiutò molto Galileo, grazie alla forte amicizia sbocciata in occasione del viaggio a Roma del 1624, particolarmente negli anni immediatamente precedenti la pubblicazione del Dialogo sopra i due massimi sistemi del mondo (Firenze, 1632). Su invito del Segretario granducale Andrea Cioli (1573-1641), prese contatti con il Maestro del Sacro Palazzo, Niccolò Riccardi (1585-1639), incaricato di revisionare l'opera, perché accelerasse il procedimento. Questi, dopo molti tentennamenti, scrisse all'Inquisitore fiorentino, non impedendo il nullaosta circa la licenza di stampa del libro.

Come è noto, il Dialogo costò allo scienziato il processo e la condanna da parte dell'Inquisizione. Nei mesi successivi alla pubblicazione, Francesco Niccolini fu costantemente in contatto sia con Andrea Cioli che con Galileo stesso, aggiornando entrambi sugli umori romani. Durante la permanenza di Galileo a Roma per il processo, l'ambasciatore lo assisté con grande affetto, arrivando a proporsi di sostenere personalmente le spese del suo mantenimento, qualora il Granduca non avesse voluto più farvi fronte. Nel periodo che seguì la condanna, si prodigò perché Galileo ottenesse la grazia e, pur non raggiungendo l'obiettivo, riuscì a fargli ottenere il permesso di risiedere a Firenze.