Leonardo si interessò ad Arezzo per la sua centralità nelle vie di comunicazione e per la sua importanza dal punto di vista strategico. La città, di antichissima origine, conservava testimonianze archeologiche uniche, come l’anfiteratro romano, inglobato nel monastero di San Bernardo ed oggi inserito nel percorso del Museo Archeologico Nazionale Gaio Cilnio Mecenate. La riscoperta archeologica di Arezzo fu assai precoce poiché, sin dalla metà del Cinquecento, in seguito alla costruzione della Fortezza, vennero alla luce eccezionali reperti di epoca etrusca come la Chimera, bronzo del V-IV sec. a.C. restaurato da Benvenuto Cellini.

Il Museo Archeologico conserva reperti ellenistici, etruschi e romani provenienti da Arezzo e dal suo territorio che influenzarono anche Donatello, Verrocchio e lo stesso Leonardo.

Nel Museo Statale d’Arte Medievale e Moderna è esposto un putto in marmo (puer mingens) del nipote di Leonardo, Pierino Da Vinci.

L’antica città etrusca di Artimino costituiva un punto di riferimento viario e strategico rispetto alla Valle dell’Arno e al Montalbano di Leonardo. L’esistenza della città, distrutta in epoca romana, continuò ad essere testimoniata da resti di mura e reperti affioranti. Alcuni di questi furono murati nella struttura della pieve romanica di San Leonardo. Altre testimonianze si conservano, invece, nel Museo Archeologico allestito entro le mura del castello medievale. Qui una sezione è dedicata alla ceramica di Bacchereto, il borgo in cui la famiglia di Leonardo possedeva una fornace "da orioli" e dove egli presumibilmente iniziò la sua esperienza artistica.

Nei pressi di Artimino si trova la Golfolina, menzionata da Leonardo nel Codice Leicester (ff. 8B-8v, 9A-9r), che una tradizione popolare identifica con una "tagliata" etrusca. Anche se quest’ipotesi non è verosimile non bisogna dimenticare che sui colli di Grumaggio, proprio di fronte al Masso delle Fate e sopra le cave di pietra, si estendono la necropoli di Prato Rosello e la città etrusca di Artimino.

Un’altra tradizione vuole che a "tagliare" la Golfolina, definita da Leonardo «sasso per antico unito co' Monte Albano in forma d'altissima argine», fosse Ercole Arameo, discendente di Noè e padre di Thuscus, da cui deriverebbe il nome della regione. Questo mito è riportato, nel 1497, da Giovanni Nanni (Annio da Viterbo) nel suo Antiquitatum variarum libri, in cui l’autore sosteneva di aver ripreso la notizia da testi di Beroso il Caldeo.

Fra le rare riproduzioni di edifici antichi rintracciabili nei manoscritti di Leonardo, spicca il disegno di un tumulo ipogeo a più camere che oggi si tende a identificare con un complesso funerario messo in luce il 29 gennaio 1507 nei pressi di Castellina in Chianti. Questo disegno (Louvre, Cabinet des Dessins), riferibile a quegli anni, riproduce infatti una struttura con soffitti a falsa volta con lastre in aggetto simile a quelle del monumento del VI secolo a.C. di Castellina. Altri particolari, tuttavia, dimostrano come il disegno, un tempo attribuito a Francesco di Giorgio Martini e ritenuto a lungo ispirato a una tomba etrusca di Cerveteri, non voglia essere un rilievo scientifico dell’edificio funerario. Leonardo prese piuttosto spunto da questa struttura per sviluppare la ricerca di forme universali che "hanno in sé [come pensava Palladio per il Pantheon] la figura del mondo". La "ruota" a sei raggi cruciformi della base del tempio progettato da Leonardo sembra, infatti, costituire una "moltiplicazione" della pianta della tomba maggiore di Monte Calvario, che presenta il dromos in parte scoperto e in parte coperto con lastre, un vestibolo con due celle laterali e una grande camera sul fondo. Nel suo insieme il tumulo circolare contiene quattro tombe in corrispondenza dei quattro punti cardinali. Lo stile del disegno ricorda, inoltre, nel tratteggio di sezione e alzato, il disegno di fortezza nel f. 117r del Codice Atlantico (c. 1507).

Leonardo mette in grande evidenza, nella carta RLW 12278, la città di Chiusi, centro di primaria importanza fin dall'epoca etrusca, come testimoniano i suoi numerosi tesori oggi raccolti nel locale Museo Nazionale e nel Museo Archeologico di Firenze.

Il declino della città ebbe origine in età medievale a causa dell’impaludamento della Val di Chiana. Chiusi è ricordata da Leonardo, ai primi del Cinquecento, nel Ms. L (f. 94v) in cui viene descritto l'itinerario da Buonconvento a Chiusi, e di qui sino a Foligno.

La riscoperta della civiltà del mondo etrusco non mancò di influenzare anche Antonio da Sangallo il Giovane e Leonardo, come testimonia per quest’ultimo lo studio della mitica tomba del Re Porsenna presente nel Codice Atlantico.

Leonardo dimostra il suo interesse per la città etrusca di Cortona nelle carte RLW 12278 e RLW 12277. La menziona, inoltre, due volte nella carta RLW 12682 per la misurazione delle distanze: «da Castiglione a Cortona miglia 5» e «Da Foiano a Cortona miglia 8».

Nel Museo dell’Accademia Etrusca è esposta la Musa Polymnia, pittura su lavagna un tempo considerata opera romana, oggi ritenuta una falsificazione rinascimentale, forse da mettere in relazione con la riscoperta della tecnica pittorica ad encausto operata da Leonardo, oppure secondo altri un’opera settecentesca ispirata dalle coeve scoperte pompeiane.

Nella Biblioteca Etrusca si conserva una copia del XVII secolo del Libro di Pittura, (Ms Zuccari, 297): "Opinione di Leonardo da Vinci. Modo di dipignere prospettive, ombre, lontananze, altezze, basezze da vicino, da lontano, et altro".

Di questa città etrusco-romana Leonardo poteva conoscere le mura (estese per un perimetro di circa km 2,5), ipotesi resa verosimile dal fatto che, nel 1503, acquistò due piccoli appezzamenti di terreno agricolo con olivi, alberi da frutta e una cava di pietra, proprio in prossimità dell’Oratorio di Sant’Apollinare e delle antiche mura. È, invece, assai improbabile che fosse a conoscenza delle rovine del teatro e del tempio.

Si interessò al "Lago di Fiesole" che in antico copriva la pianura di Firenze-Prato-Pistoia e disegnò i colli di Fiesole nel foglio 20v del Codice di Madrid II.

Nel Codice sul volo degli uccelli Fiesole è menzionata tre volte: una per l’avvistamento del cortone "uccello di rapina" il 14 marzo 1505 o 1506 e due per la profezia del volo dal Monte Ceceri; e una volta nel Ms. G, a proposito di una "sagoma di lastra da Fiesole".

Nella carta RLW 12278, Leonardo indica questo antico insediamento a sud di Siena. Nei pressi segnala "Munistero", probabilmente identificabile con Vescovado di Murlo.

Sul finire del VII secolo a.C. non lontano dal centro medievale, in località Poggio Civitate, sorse un imponente palazzo etrusco messo in luce nella seconda metà del XX secolo.

Nel Ms. L Leonardo indica due volte, intorno al 1502, il litorale e il promontorio di Populonia, l’unica grande città etrusca fondata sul mare, con il porto nel Golfo di Baratti, tra Piombino e San Vincenzo.

Populonia raggiunse il suo massimo splendore nel VII e VI secolo a.C, anche se già dall’VIII secolo era iniziato lo sfruttamento sistematico delle miniere di metalli presenti nell’antistante Isola d’Elba. A testimonianza del passato splendore rimangono le grandiose architetture dei tumuli, gli arredi funerari e i reperti rinvenuti nei relitti affondati nella baia di Baratti.

Con la denominazione antica di "Suana", Leonardo raffigura in grande evidenza la città etrusca di Sovana, in comune di Sorano, nelle carte RLW 12278 e RLW 12277.

Fu un centro importante sin dal VII secolo a.C. e mantenne la sua centralità anche in epoca imperiale. Notevoli infatti le persistenze etrusche: le strade come il Cavone, le necropoli rupestri, le tombe di Ildebranda e della Sirena.

La Rocca Aldobrandesca è ciò che resta dell'antico castello medievale.

Leonardo disegna, con molti dettagli, secondo due diversi punti di vista, la città etrusca di Volterra, nelle carte RLW 12683 (da est) e RLW 12278 (da ovest), e ne segnala l'importanza strategica in relazione alla Val di Cecina e alla Valdera nella carta idrografica RLW 12277.

In epoca medievale e rinascimentale il territorio di Volterra era al centro delle mire espansionistiche di Pisa e Firenze a causa delle sue risorse minerarie. Sicuramente Leonardo conosceva resti architettonici della città etrusco-romana come le mura, che nel IV secolo a.C. misuravano 7.280 metri, e la Porta dell’Arco.

La raffinatezza delle arti e la ricchezza dell’antica Volterra sono ampliamente testimoniate dai reperti che, sin dall’inizio del XVIII secolo, furono amorevolmente raccolte nel Museo Guarnacci.