In questa sala si può seguire il progressivo perfezionamento del cannocchiale, a partire dai primi esemplari messi a punto nel 1610 da Galileo (si possono ammirare gli unici due telescopi pervenutici dei molti costruiti nella propria officina) grazie ai quali lo scienziato pisano conferì un impulso inaudito alla ricerca astronomica, realizzando sensazionali scoperte. Grazie al nuovo strumento, egli osservò, infatti, che la Luna presenta valli e rilievi come la Terra, che la Via Lattea è un enorme ammasso di stelle e che Giove è circondato da quattro satelliti; successivamente osservò le strane apparenze di Saturno, le fasi di Venere e le macchie solari. L'evoluzione del cannocchiale, che ne segnò la trasformazione, da giocattolo artigianale a essenziale strumento di ricerca è documentata in questa sala, oltre che dagli strumenti di Galileo, anche da quelli di Evangelista Torricelli, di Eustachio Divini e di Giuseppe Campani. Merita sottolineare, infine, la presenza del primo strumento a visione binoculare, donato dal suo ideatore, Chérubin D'Orléans, a Cosimo III de' Medici.