Anche l'espressione dei sentimenti e delle emozioni è considerata da Leonardo come un'attività motoria, che innesca l'azione dei muscoli, la contrazione delle labbra e degli occhi, la formazione delle rughe e, più in generale, la gestualità comunicativa.

Egli ritrae dal vero le espressioni e indaga le basi anatomiche e fisiognomiche del carattere e delle reazioni emotive. Il Cenacolo rappresenta la massima sintesi di questa ricerca.