Nato a Pisa, studiò nella locale Università fisica e astronomia con Carlo Matteucci (1811-1868) e Ottaviano Fabrizio Mossotti (1791-1863). Trasferitosi a Firenze, lavorò intensamente nell'osservatorio astronomico annesso al Museo di Fisica e Storia Naturale, utilizzandone la strumentazione - in particolare gli obiettivi di Giovanni Battista Amici (1786-1863) - per l'osservazione e la ricerca delle comete. Subentrato nel 1859 ad Amici nella direzione della Specola del Museo fiorentino, continuò gli studi spettroscopici precedentemente iniziati. Le sue osservazioni sugli spettri stellari furono i primi studi di carattere astrofisico compiuti a Firenze e tra i primi nel mondo. Donati promosse anche la costruzione del nuovo osservatorio di Firenze sulla collina di Arcetri.