Formatosi presso la Scuola medico-chirurgica pistoiese, nel 1835, quando era ancora studente, presentò alla Società Medico-Fisica Fiorentina un'importante relazione nella quale veniva illustrata la scoperta dei corpuscoli dei nervi digitali, che oggi portano il suo nome. Fece studi di istologia e ricerche sulla patologia del colera; vide e disegnò per primo il vibrione che nel 1884 fu descritto da Robert Koch (1843-1910) come l'agente patogeno del colera. Dal 1847 fu professore di anatomia e istologia presso l'Istituto di Studi Superiori di Firenze. Studiò anche la fisiologia dell'apparato muscolare e in funzione delle proprie ricerche perfezionò il microscopio. Gli scritti autografi del Pacini sono conservati presso la Biblioteca Nazionale Centrale di Firenze.