Di nobile famiglia fiorentina, studiò a Pisa ed ebbe come maestri grandi personalità come Marcello Malpighi (1628-1694) e Giovanni Alfonso Borelli (1608-1679). A Firenze si avvalse dell'amicizia e del magistero di Vincenzo Viviani (1622-1703). Fu nominato nel 1660, ancora giovanissimo, Segretario dell'Accademia del Cimento. Redasse i Saggi di naturali esperienze (Firenze, 1667), che contengono l'ordinata esposizione dei più rilevanti esperimenti eseguiti dagli accademici. Compì lunghi viaggi, dapprima a titolo personale, poi come diplomatico del Granduca di Toscana Ferdinando II (1610-1670) e, in seguito, del Granduca Cosimo III (1642-1723). Un'incrinatura improvvisa dei rapporti con Cosimo III interruppe, nel 1678, la folgorante carriera e i viaggi dell'erudito, che si ritirò per un decennio dalla vita pubblica dedicandosi alla stesura delle Lettere familiari, pubblicate postume a Venezia nel 1719. Riprese la vita pubblica nel 1689 (con l'incarico di "terzo consigliere di Stato") e l'intensa attività di scrittore (inizia in questi anni la stesura delle Lettere su le terre odorose d'Europa e d'America dette volgarmente buccheri). Galileiano, poi libertino e amico di Saint-Évremond, infine seguace della filosofia corpuscolaristica di Pierre Gassendi (1592-1655), Magalotti visse in pieno il contrasto tra nuova scienza e ortodossia religiosa, e approdò a pratiche ascetiche che lo spinsero a indossare per qualche tempo l'abito della congregazione di S. Filippo Neri. La tensione tra nuova scienza e ortodossia religiosa anima le sue Lettere familiari contro l'ateismo.