Vincenzo Galilei nacque intorno al 1520 a Santa Maria a Monte, nel Valdarno, dove il nonno Giovanni si era trasferito verso il 1470 da Firenze, probabilmente in seguito a un rapido declino economico della famiglia. Fu liutista, compositore e teorico musicale. Dopo un periodo di studio a Venezia sotto la guida del maestro Gioseffo Zarlino (1517-1590), si trasferì a Pisa sul finire degli anni Cinquanta del Cinquecento, dove esercitò la professione di maestro di musica e forse anche di mercante di tessuti. Sposò nel 1562 la giovane Giulia Ammannati (1538-1620) e dal matrimonio nacquero Galileo (1564), Benedetto (?), Virginia (1573), Anna (?), Michelangelo (1575), Livia (1578) e forse un'ultima figlia di nome Lena.

La famiglia Galilei si stabilì nel 1574 a Firenze, dove Vincenzo, che vi viveva già da qualche anno, ebbe la possibilità di attendere ai propri studi musicali, grazie soprattutto alla protezione del conte Giovanni Bardi (1534-1612). Questi aveva raccolto attorno a sé la Camerata fiorentina (detta, appunto, Camerata de’ Bardi), la quale, affermando nelle proprie creazioni musicali la superiorità del canto monodico sulla polifonia, contribuì al cambiamento di gusto che avrebbe portato in seguito alla nascita del melodramma. Questa stessa idea è alla base del Dialogo della musica antica et della moderna, che Vincenzo Galilei pubblicherà nel 1581.

Forte delle opinioni dell'umanista Girolamo Mei (1519-1594), entrò in polemica con lo Zarlino, la cui teoria musicale affermava, secondo la tradizione, che le consonanze e dissonanze musicali dipendevano esclusivamente da rapporti matematici in accordo con la teoria pitagorica. Secondo Galilei, invece, alla teoria doveva essere affiancata l'esperienza, in quanto i rapporti matematici devono essere applicati a dei corpi sonori materiali. Così attraverso veri e propri esperimenti il musicista toscano riuscì a dimostrare come la diversità delle caratteristiche fisiche possa produrre risultati acustici diversi. Questo ricorso all'esperienza come verifica dell’incontro tra matematica e fisica fa di Vincenzo Galilei il primo maestro del figlio maggiore, il quale ereditò dal padre, oltre all'approccio metodologico, anche la forza polemica e la fine ironia.

Oltre al Dialogo della musica antica et della moderna (Firenze, 1581): pubblicò anche il Fronimo. Dialogo nel quale si contengono le vere et necessarie regole del intavolare la musica nel liuto (Venzia, 1568) e il Discorso intorno alle opere di Gioseffo Zarlino et altri importanti particolari attenenti alla musica (Firenze, 1589).