Vincenzo Galilei, terzo e ultimo figlio di Galileo, nacque il 21 agosto del 1606 a Padova. Inizialmente non fu riconosciuto, come del resto le due sorelle maggiori, ma nel 1619 il padre, attraverso Curzio Picchena, chiese e ottenne la legittimazione dal Granduca di Toscana Cosimo II (1590-1621). Il diverso trattamento tra i figli fu dovuto al fatto che Vincenzo, a differenza delle ragazze, non avrebbe avuto necessità di una dote commisurata alla posizione sociale.

All'inizio del 1622, a 15 anni, fu mandato a studiare a Pisa sotto la supervisione di Benedetto Castelli (1577/8-1643), discepolo e amico di Galileo. Il temperamento arrogante e ostinato del ragazzo resero la sua istruzione problematica e il Castelli ebbe a lamentarsene con Galileo.

Nel 1624 lo scienziato si recò in visita dal nuovo papa Urbano VIII (1568-1644) dal quale sperava di ricevere appoggio per i suoi studi; pur non ottenendo quanto avrebbe desiderato, a Galileo fu assicurata una pensione per il figlio. La storia della pensione occupò lo scienziato per diversi anni e si risolse con l'intervento del "cardinal nipote" Francesco Barberini (1597-1679) nel 1627. Proprio quando le cose sembravano volgere al termine, Vincenzo dimostrò, secondo le parole di Castelli in una lettera a Galileo del 21 maggio 1627, "un odio avvelenato, non una semplice aversione d'animo, al clericato". Per divenire beneficiario del fondo, infatti, Vincenzo avrebbe dovuto ricevere la tonsura. questa forte resistenza del giovane fece sì che il privilegio venisse girato al nipote Vincenzo (1608-?), figlio di Michelangelo Galilei (1575-1631), che si trasferì così a Roma al posto del cugino. Nel frattempo Galileo chiese e ottenne dal Granduca Ferdinando II (1610-1670) un posto nel Collegio della Sapienza di Pisa per Vincenzo, il quale vi si laureò in legge nel giugno del 1628.

Pochi mesi dopo, all'inizio del 1629, il giovane si sposò con Sestilia Bocchineri. Il matrimonio fu accolto da generale soddisfazione, perché la giovane era di buona famiglia. Suor Maria Celeste e Suor Arcangela, sorelle dello sposo, parteciparono dal convento di San Matteo in Arcetri ai preparativi della festa che si svolse a Prato. Dal matrimonio nacquero tre figli: Galileo, Carlo e Cosimo. Il piccolo Galileo o Galileino, come lo chiamava la zia Virginia (Suor Maria Celeste) nelle sue lettere, fu lasciato alle cure del nonno durante gli anni della peste: il figlio e la nuora, incinta del secondogenito, erano fuggiti, infatti, a Montemurlo nel 1630 per mettersi al sicuro, mentre lo scienziato aveva preferito rimanere a Firenze.

I primi anni dopo il matrimonio non furono facili per Vincenzo, che non riusciva a trovare un impiego stabile, e le questioni economiche lo misero più volte in attrito col padre. Probabilmente per intercessione di Galileo, finalmente, Vincenzo trovò impiego presso la cancelleria di Poppi, nel Casentino. Da una lettera del cognato Geri Bocchineri a Galileo del novembre 1633 è noto, però, che il lavoro del giovane fu presto messo a repentaglio dalla sua negligenza. Pare, infatti, che Vincenzo dedicasse le ore lavorative a una sua invenzione piuttosto che all'ufficio per il quale veniva pagato. Nel 1634 arrivò il trasferimento da Poppi a San Giovanni Valdarno e, infine, nel 1635 la nomina a Cancelliere dell'Arte dei Mercanti e della Zecca di Firenze, incarico che mantenne fino alla morte.

Nel 1638, rasserenato dalla ritrovata stabilità del figlio, Galileo lo nominò amministratore di tutti i suoi beni e alla morte lo lasciò erede universale.

Insieme a Vincenzo Viviani (1622-1703), ultimo discepolo di Galileo e suo primo biografo, Vincenzo lavorò all'applicazione del pendolo all'orologio; fu inoltre abile inventore e costruttore di strumenti musicali.