Si deve a Cosimo I de' Medici l'idea di costruire a Pisa un arsenale per le navi della potente flotta toscana. Già funzionante intorno al 1540, il nuovo cantiere navale mediceo varò, nel 1546, la prima galera interamente costruita da maestranze locali. L'Arsenale, alla cui realizzazione partecipò anche il Buontalenti, era articolato in otto navate lunghe mediamente 60 metri, alte 8 e larghe circa 10. Faceva parte di un progetto volto a restituire a Pisa l'antico splendore, perso dopo la resa della città ai fiorentini nel 1509. L'istituzione, nel 1562, dell'Ordine di Santo Stefano e il trasferimento nel 1563 del Giardino dei Semplici nella stessa area rientrano in questa ottica. La concorrenza dei cantieri di Livorno e Portoferraio e una mutata politica marittima, tuttavia, ne decretarono presto un lento ma inesorabile declino fino a che, alla metà del secolo XVIII, sotto i Lorena, i locali furono trasformati per accogliere i cavalli del reggimento dei Dragoni.

Nell'area restaurata degli Arsenali sono allestite, oggi, alcune esposizioni che presentano una parte degli importanti ritrovamenti, avvenuti a partire dal 1998, di relitti di imbarcazioni e suppellettili rinvenuti nell'antica area portuale etrusca e romana di Pisa, ubicata nella zona della stazione ferroviaria di Pisa-San Rossore. Si tratta di una prima struttura portuale di età arcaica, con i relitti di 19 imbarcazioni di diversa stazza (dalla nave oneraria al barchino fluviale) risalenti ad un periodo compreso tra la fine dell'età ellenistica e l'età tardo antica. Tali scoperte costituiscono un elemento fondamentale nella comprensione delle modalità di trasporto marino nell'antichità tra il V secolo a.C. e il V d.C.

Negli Arsenali dei Cavalieri di Santo Stefano è in allestimento il Museo delle Navi, che presenterà i reperti in uno spettacolare apparato espositivo. Concepita come "esposizione in progress", la Mostra delle Navi vorrebbe, infatti, rendere partecipe il visitatore della varie fasi del lavoro di recupero svolto, dallo scavo archeologico, al laboratorio di restauro all'esposizione finale, ma non definitiva, dei materiali.