La Biblioteca Universitaria di Pisa fu aperta al pubblico nel 1742 nei locali di via Santa Maria sotto la Specola. Il fondo iniziale, costituito in gran parte dalla biblioteca privata del giurista Giuseppe Averani, si arricchì grazie alle accessioni, nel 1757, della biblioteca dell'erudito Anton Francesco Gori (circa 6.000 volumi) e, nel 1771, per volere del Granduca Pietro Leopoldo di Lorena, di molti volumi doppi della Biblioteca Mediceo-Palatino-Lotaringia. Nel 1783 alla Biblioteca Universitaria pervenne il ricco patrimonio librario del monastero dei Camaldolesi di San Michele in Borgo, arricchito dal matematico Padre Guido Grandi. Sono i manoscritti appartenuti a Grandi a costituire il nucleo più rilevante del fondo, con scritti di idraulica, matematica, fisica, meccanica. Di particolare interesse risulta il carteggio, che comprende circa 4.000 lettere tra il matematico pisano e illustri corrispondenti come Alessandro Marchetti, Antonio Magliabechi, Eustachio Manfredi, Antonio Vallisneri.

Trasferita nel palazzo della Sapienza nel 1823, la Biblioteca registrò un ulteriore e significativo ingrandimento sotto la direzione dell'astronomo Giuseppe Piazzini. Parte del notevolissimo patrimonio è costituito da lettere di Galileo Galilei e di altri illustri scienziati dell'ateneo pisano, oltre ad alcuni cimeli e al fondo dell'antico Orto botanico. Da segnalare anche l'importante fondo di manoscritti dell'egittologo Ippolito Rosellini, che fu anche direttore della Biblioteca pisana dal 1835 al 1843.

La Sapienza accolse gli scienziati riuniti a convegno durante il Primo Congresso degli Scienziati Italiani (1839), voluto da Luciano Bonaparte e sostenuto dal Granduca Leopoldo II. In questa occasione venne inaugurata la statua di Galileo Galilei, scolpita da Paolo Emilio Demi, oggi conservata nell'Aula Magna storica. Fra i cimeli galileiani, si segnala un busto ottocentesco in gesso raffigurante Galileo e un dipinto di Antonio Caimi (1946) con lo scienziato pisano in atto di presentare il cannocchiale al Senato veneto, donato alla Biblioteca Universitaria dal Prefetto Luigi Torelli in occasione del terzo centenario della nascita di Galileo, svoltosi a Pisa nel febbraio 1864.