L'antichissimo Spedale, istituito dai canonici del Duomo per accogliere i pellegrini e per assistere i poveri e i bambini abbandonati, risulta già citato in un documento del 1090. L'appellativo "della Scala" deriva dalla sua posizione, proprio di fronte alla scalinata del Duomo. Le attività assistenziali e la vita quotidiana dell'ospedale sono mirabilmente descritte nel ciclo di affreschi del cosiddetto "Pellegrinaio", eseguiti tra il 1441 e il 1444 da Domenico di Bartolo, Lorenzo Vecchietta, Priamo della Quercia (fratello di Jacopo) e Pietro di Giovanni d'Ambrosio, su commissione del Rettore dell'Ospedale Giovanni Buzzichelli. Il Pellegrinaio è un grande ambiente destinato ad accogliere i pellegrini, che rivela uno stile architettonico di chiara derivazione francese, testimonianza degli scambi costanti tra Siena e l'Europa, resi possibili dalla via Francigena. Questa enorme arteria, ancora visibile e in parte percorribile, collegava l'Italia con il Nord Europa ed era percorsa annualmente dalle migliaia di pellegrini che si recavano verso i grandi santuari (San Pietro, San Jacopo di Compostella, Montauban). Ebbe, per questo, una notevole importanza nella nascita e nello sviluppo di numerosi ospedali che, a partire dal secolo XI, sostituirono i cosiddetti 'Xenodochi' (dal greco xenos = straniero e dokeion = ostello). I viaggiatori del Medioevo, spesso in balia di predoni ed esposti al continuo pericolo di malattie contagiose, trovavano in queste strutture non solo un letto per passare la notte, ma anche infermerie, stalle e magazzini per depositare le mercanzie.

Lo Spedale di Santa Maria della Scala, grazie alle cospicue elemosine e ai lasciti dei pellegrini, in breve tempo conseguì un’autonomia, sul piano economico, di tale rilievo da consentire lo sviluppo di un’organizzazione indipendente dal potere religioso e regolata da un innovativo statuto degli inizi del Trecento. La gestione andò progressivamente laicizzandosi fino al 1404, anno in cui il Comune si avocò il diritto di eleggere il Rettore, massima autorità dell'ente. Inoltre, l'enorme patrimonio agricolo dello Spedale, rappresentato dalle "grance", costituì per la città una fonte di sussistenza in tempi di carestie e di epidemie.

Nel 1411 fu istituita la spezieria, che nel secolo XVI si arricchì di un importante corredo ceramico per lo più di produzione locale: nel 1518 risultavano circa 1.800 vasi, dei quali oggi rimangono soltanto scarse testimonianze esposte all'interno dello Spedale. Nel 1588 risulta che allo Spedale era annesso anche un Giardino dei Semplici.

Sempre attivo nel corso dei secoli, lo Spedale stipendiò un dissettore anatomico (1743), maestri di chirurgia, maestri di parti e di anatomia (1759); formulò, inoltre, regole per il tirocinio dei medici praticanti e degli studenti interni, si assicurò la consulenza di cattedratici per i casi complessi, migliorò l'assistenza ai dementi e alle partorienti. Nel 1778 l'Università e l'Ospedale si divisero in maniera paritaria le spese per meglio dotare il gabinetto anatomico. Nel Settecento spicca l'opera di Paolo Mascagni, docente di Anatomia nella stessa Università. Ai primi del XIX secolo fu istituito l'obbligo per i neolaureati di effettuare presso l'Ospedale un periodo di tirocinio pratico, biennale per i medici e quinquennale per i chirurghi.

Oggi, l'antico Spedale di Santa Maria della Scala è un grande e suggestivo complesso museale che accoglie importanti collezioni senesi di storia dell'arte e di storia della sanità.