Le origini della Confraternita risalgono agli inizi del secolo XV. Dopo alterne vicende e dopo aver assunto diverse denominazioni, nel 1864 si trasformò in Pia Misericordia di Buonconvento, adottando nuovi statuti. Il Museo conserva prevalentemente opere d'arte e oggetti liturgici, ma è presente anche una collezione derivante dall'attività di assistenza sanitaria esercitata dalla Confraternita. La raccolta scientifica comprende oggetti del XIX e XX secolo, fra i quali si segnalano una valigetta di pronto soccorso con medicinali e oggettistica in vetro, tra cui un pappagallo per donna, e una delle prime ambulanze ("carrino di volata") utilizzata dalla Confraternita.

Il 14 settembre 2002, al termine di lavori per il recupero strutturale e funzionale dei locali, è stato inaugurato il nuovo percorso museale, che accoglie, oltre agli oggetti provenienti dalla collezione della Confraternita, anche quelli di altre istituzioni del territorio.