Ospitato nella chiesa di San Giovanni Battista, le cui prime notizie risalgono al 1126, il Museo della Vetrata Antica di Sansepolcro, aperto nel 2003, costituisce uno dei primi tentativi organici in Italia di creare un museo dedicato alle vetrate. Accoglie prevalentemente opere databili tra la fine dell'Ottocento e gli inizi del Novecento, tra cui si distingue la copia a grandezza naturale, in vetro dipinto, dell'Ultima Cena di Leonardo realizzata, tra il 1937 e il 1942, da Rosa e Cecilia Caselli e donata alla cittą dal concittadino Luigi Fatti. Della Collezione Giuseppina Bernardini, invece, fanno parte vetrate di soggetto sacro databili a partire dalla seconda metą dell'Ottocento, come una grande Crocifissione, capolavoro dell'arte preraffaellita inglese.

Particolare interesse, da un punto di vista scientifico, riveste l'esposizione di una campionatura di vetrate (figurate e non), arricchita da una raccolta di bozzetti, tavole a colori e incisioni di fine Settecento che, insieme a materiali di botteghe artigiane e testi che illustrano la storia, la lavorazione e il restauro delle vetrate, consentono di ripercorrere le tappe di questa antica arte. Su appuntamento sono, inoltre, possibili dimostrazioni di lavorazione della vetrata tradizionale legata a piombo.