Una "Galleria" o Museo di Storia Naturale, contenente anche materiali vegetali, fu istituita presso l'Orto Botanico pisano verso il 1591 per iniziativa del Granduca Ferdinando I de' Medici, il quale contribuì ad arricchire le collezioni con pezzi preziosi e rarissimi, secondo il gusto del tempo. Oggi del Museo cinquecentesco restano solo alcuni locali, ai quali si accede dall'Orto Botanico, mentre i materiali sopravvissuti sono conservati nel Museo di Storia Naturale di Calci.

Verso la fine del Settecento iniziò l'organizzazione dell'attuale Museo Botanico, grazie all'impegno di Gaetano Savi, professore di Botanica e direttore dell'Orto fino al 1842. Attualmente il Museo conserva materiali vegetali e collezioni di piante raccolte fin dalla sua origine a scopo di ricerca, di studio e come ausilio all'attività didattica. In particolare, l'Erbario Generale è formato dalle raccolte universitarie databili dal secolo XVIII ad oggi, mentre altri Erbari Personali, costituiti da raccolte realizzate da diversi botanici, furono acquisiti dall'Università dalla fine dell'Ottocento al 1960 circa. Da segnalare anche tre collezioni: la xilologica, con sezioni longitudinali e trasversali del fusto di varie specie arboree; la collezione di campioni vegetali con campioni di frutti, fiori, infiorescenze e semi; la collezione di fossili provenienti dalla Toscana e dal Lazio, dispersa in seguito agli eventi bellici della Seconda Guerra Mondiale, e ritrovata negli anni Novanta.

Di rilievo sono anche i modelli ceroplastici di frutti, macromiceti e parti anatomiche di varie piante, eseguiti fra il 1830 e il 1840 dal celebre ceroplasta fiorentino Luigi Calamai, e le tavole didattiche, formate da grandi pannelli disegnati a matita o a inchiostro, talvolta colorati ad acquerello, realizzati prevalentemente da Enrico Cristofani nella seconda metà dell'Ottocento.

Il Museo condivide con l'Orto Botanico la Biblioteca e l'Archivio, conservati presso la ricca Biblioteca del Dipartimento di Scienze Botaniche.