Iniziato nel 1583 per volontà del Granduca Francesco I de' Medici, che ne affidò il progetto a Bernardo Buontalenti, il Palazzo doveva sostituire il più antico Palazzo mediceo (oggi sede della prefettura). Costruito inglobando edifici preesistenti, come la duecentesca Torre della Verga d'Oro, appartenuta alla famiglia Gaetani, e la torre del Cantone, ancora visibile, l'edificio subì numerosi rimaneggiamenti tra il XVII e il XIX secolo. Residenza della Corte nei soggiorni pisani, ospitò celeberrimi scienziati come Galileo Galilei, che illustrò le sue scoperte astronomiche dalla medievale torre della Verga d'Oro, e Francesco Redi, che vi morì il 1 marzo 1697.

Il Museo Nazionale, allestito dal 1989 nelle sale del Palazzo mantenendo l'aspetto della dimora di Corte, accoglie oggi numerose opere d'arte (arazzi, ritratti, dipinti di vario soggetto e armature storiche) appartenute ai Medici, ai Lorena e ai Savoia.