L'Orto botanico pisano, o "Giardino dei semplici" fu istituito, nei pressi della chiesa di San Vito, nel 1544, per volontà di Cosimo I de’ Medici, con l’intento di raccogliere piante ed erbe dotate di proprietà medicinali e farmacologiche, dette appunto simplicia. Si trattava del primo orto botanico abbinato ad una struttura universitaria. La disposizione dell'orto fu affidata a Luca Ghini, celebre botanico imolese. Nel 1563 l'Orto fu trasferito presso il convento di Santa Marta e, infine, nel 1591, trovò la sistemazione definitiva in via Santa Maria. Numerosi furono gli scienziati che contribuirono al suo sviluppo e alla sua fama, come i botanici Luca Ghini, Andrea Cesalpino, Giuseppe Casabona, Pietro Nati, Michelangelo e Angelo Attilio Tilli, Giorgio Santi, Gaetano Savi, Teodoro Caruel.

Una galleria di reperti naturali e artificiali, un laboratorio chimico e una biblioteca (confluita in gran parte nella Biblioteca Universitaria) furono annessi all'Orto. Tra la fine del Settecento e l'inizio dell'Ottocento fu ristrutturato il laboratorio chimico e furono realizzati una serra e un tepidarium. Sempre nell'Ottocento, fu costruito l'edificio che oggi ospita il Dipartimento di Scienze Botaniche, con i Laboratori e l'Erbario.

Nei secoli XVI-XVIII, il Giardino divenne sede di una vera e propria "bottega artistica" in grado di produrre immagini naturalistiche spesso di altissima qualità. Manuali di progetti di aiuole e compartimenti, tavole botaniche e zoologiche, cere botaniche, disegni, dipinti e incisioni di soggetto non solo naturalistico, furono eseguiti dagli artisti operanti nel Giardino a stretto contatto con gli scienziati. Significativa l'attività pisana di Daniel Froeschel, artista operante alla corte rudolfina, di Giorgius Dyckman, che accompagnò Casabona nel viaggio a Creta, o ancora di Filippo Paladini.

Attualmente la collezione di piante vive comprende una banca dei semi, un arboreto, la collezione sistematica, una sezione dedicata alle geofite mediterranee ed una dedicata alla flora faraonica, piante medicinali, piante tropicali, palme. Della collezione fanno parte anche piante ultracentenarie. Didattica, conservazione, divulgazione e ricerca costituiscono le principali attività cui sono finalizzate le collezioni.

L'Orto condivide con il Museo Botanico la biblioteca e l'archivio, ospitati presso la Biblioteca del Dipartimento di Scienze Botaniche.