Le prime notizie dell'Ospedale risalgono al 1309, quando, accanto alla Cattedrale di San Lorenzo, fu iniziata la costruzione dell'Ospedale di San Giovanni Battista (il cui nome era tradizionalmente legato alla Misericordia). Soppressa la Misericordia di Siena, l'Ospedale, nel 1466, divenne possesso del senese Santa Maria della Scala, di cui rappresentò una sorta di succursale; dopo la caduta della Repubblica di Siena, fu destinato, nel 1591, ad accogliere i soldati del Granduca Ferdinando I de' Medici. Fu, inoltre, dotato di una spezieria affidata al vicino convento dei frati francescani. Nel 1771, per volere del Granduca Pietro Leopoldo di Lorena, l'Ospedale della Misericordia fu sottratto all'amministrazione dell'Ospedale senese e affidato al Provveditore dell'Ufficio dei Fossi, in conformità al progetto di risanamento della Maremma che prevedeva anche una riorganizzazione dell'assistenza sanitaria. Nel corso della prima metà dell'Ottocento l'Ospedale perse la sua centralità, anche perché, a causa della bonifica della Maremma attuata dal Granduca Leopoldo II di Lorena nel 1828, dovette rinunciare ai proventi del Lago di Castiglione che dal 1795 gli garantivano la sussistenza.