Citato per la prima volta in un documento del 1280, lo Spedale è certamente di origine più antica, ma la data di fondazione è ignota a causa della distruzione dell'archivio nell'incendio del 1444. Dalla metà del secolo XVI si formò un unico e cospicuo patrimonio immobiliare, accresciuto da donazioni testamentarie e dai lasciti dei Rettori succedutisi nel Governo Ospedaliero: da tale processo nacque il vero ospedale e il ruolo assistenziale, che lo aveva caratterizzato fin dal suo sorgere, lasciò il posto ad una finalità prettamente curativa, affidata alla presenza di un medico e di un cerusico.

In seguito alla cattiva gestione del patrimonio dello Spedale, si cercò di meglio controllare le spese: nel 1782, un rescritto granducale ne limitò le competenze al solo ambito della cura dei malati, mentre con la riforma del 1788 ricevette un assetto definitivo. Da quel momento fu, ad esempio, lo stesso Granduca ad eleggere direttamente il Rettore, il quale non avrebbe abitato più nella casa annessa allo Spedale destinata, invece, al Medico Chirurgo. Dopo l'Unità d'Italia l'ente, come gli altri ospedali della Toscana, passò sotto l'amministrazione dallo Stato.

La collezione di strumenti medici, costituita da ferri chirurgici, vetreria e suppellettili sanitarie databili tra i secoli XVIII e XX, è esposta nella Sacrestia della Chiesa di San Francesco, attigua all'Ospedale.