Fu voluto da Cosimo I de' Medici ma realizzato solamente negli anni successivi al suo granducato. Il progetto originario prevedeva la costruzione di due moli paralleli che dovevano raggiungere, rispettivamente, il Fanale dei Pisani e la Fortezza Vecchia. Il primo braccio, fatto costruire da Ferdinando I, si arrestò prima del previsto, sulla scogliera della Sassaia, mentre il secondo fu realizzato sotto Cosimo II. Agli stessi anni si deve anche l'allestimento dell'ampia darsena antistante la Fortezza Vecchia ed il completamento del canale navigabile tra Pisa e Livorno. Protetto da una catena di scogli, poi rimossa nel 1864, il porto non poteva contenere molti bastimenti a causa della scarsa profondità dei fondali. Ad una certa distanza dal porto furono costruiti dei lazzaretti per la quarantena delle navi che giungevano da paesi che potevano veicolare epidemie.

Significativi furono gli interventi dell'ultimo Granduca di Toscana, Leopoldo II. Nel 1852 decretò l'erezione di un imponente muraglione curvilineo, distante dall'antico molo 800 metri. Lungo 1130 metri e profondo in media 8,50 metri, il nuovo porto distava dal Fanale 400 metri. Nel mezzo dell'antico molo fu scavato un canale in grado di servire da transito alle navi che dovevano entrare nella darsena del cantiere per le riparazioni. Inoltre, per rendere più facili e più celeri le comunicazioni fra il mare e la terra, tra le navi e la via ferrata, deliberò la realizzazione della stazione marittima. Progettata dall'ingegnere Giuseppe Laschi, la costruzione della stazione ebbe inizio nel 1856: fu colmato a tal fine un vasto spazio di mare, scavata una darsena quadrilatera per comodità delle barche, ed eretti lungo i suoi lati grandi capannoni per il deposito delle mercanzie. Dalla parte di terra fu realizzato un edificio per accogliere gli uffici, mentre uno più piccolo fu edificato in mezzo all'acqua per ospitare le guardie di finanza. La via ferrata, prima di arrivare alla stazione San Marco, attraversava il Canale dei Navicelli su un ponte girevole di ferro, per giungere alla darsena e proseguire poi lungo i moli del deposito franco. La stazione marittima fu inaugurata il 12 agosto 1858.

Il porto mediceo di Livorno è un luogo della scienza associato al nome di Galileo Galilei. Tra il 1590 e il 1592 don Antonio de' Medici propose una macchina per vuotare la darsena di Livorno e Galileo, secondo quanto riferisce Vincenzo Viviani nel Racconto istorico, espresse un giudizio negativo.

Lo scienziato pisano utilizzò il porto anche per alcuni esperimenti con il cannocchiale. Il 22 marzo 1617 Galileo scriveva da Pisa a Curzio Picchena, descrivendogli l'esperienza compiuta con il "celatone", un dispositivo concepito per utilizzare il cannocchiale su una nave anche con il mare mosso. Galileo dichiarava di aver potuto verificare l'effetto dell'occhiale solo sopra una navetta dentro al molo, poiché non c'erano vascelli fuori. Il moto dell'acqua era scarso, anche se il vento era fortissimo, e quel poco movimento non danneggiava l'uso dell'occhiale.