Lo Studium Generale di Pisa fu istituito ufficialmente nel 1343 con bolla pontificia "In supremae dignitatis" di Papa Clemente VI. Il provvedimento attivò di fatto presso l'istituzione pisana le facoltà di Teologia, Diritto Canonico e Civile, Medicina, lasciando aperta la possibilità di istituire ulteriori corsi di studio. Dopo poco più di sessanta anni, con l'annessione di Pisa al governo di Firenze, cessò l'attività dello Studio, e solo Lorenzo il Magnifico lo riportò a nuova vita nel 1473. Tra la fine del Quattrocento e gli inizi del Cinquecento lo Studio fu trasferito in altre sedi, come Pistoia e Prato; a causa della ribellione della città di Pisa al dominio fiorentino passò, infine, a Firenze, per poi tornare nella sede originaria nel 1515. Si deve a Cosimo I la sua riorganizzazione in uno dei principali centri europei di ricerca e di insegnamento scientifico. Con la solenne riapertura nel 1543 lo Studio fu dotato di nuovi statuti che lo resero competitivo rispetto alle altre università italiane ed europee. Accanto alle norme protezionistiche, tra cui le disposizioni che obbligavano gli studenti fiorentini a laurearsi nell'università del loro Stato, furono emanati alcuni provvedimenti per il potenziamento dell'attività didattica e della ricerca nel settore scientifico, che di fatto assicurarono allo Studio il carattere di istituzione "internazionale". Fra gli illustri scienziati che operarono nell'Università è d'obbligo ricordare Andrea Vesalio (Anatomia), Luca Ghini (Medicamenti semplici), Realdo Colombo (Anatomia), Gabriele Falloppia (Anatomia), Andrea Cesalpino (Medicamenti semplici e Medicina pratica), Galileo Galilei (Matematica), Girolamo Mercuriale (Medicina pratica), Giovanni Battista Ruschi (Anatomia), Benedetto Castelli (Matematica), Giovanni Alfonso Borelli (Matematica), Marcello Malpighi (Medicina teorica), Lorenzo Bellini (Anatomia), Antonio Cocchi (Medicina teorica).

Nella seconda metà del Settecento i granduchi lorenesi diedero un nuovo impulso all'istituzione dotando lo Studio di una specola astronomica, e istituendo nuove cattedre scientifiche, tra le quali quella di chimica (1757), assegnata a Nicola Branchi, e di fisica sperimentale. Fu in quegli stessi anni che l'insegnamento della chirurgia ricevette nuovo impulso e sviluppo, grazie all'opera di Francesco Vaccà Berlinghieri.

Durante il periodo napoleonico lo studio fu trasformato in Accademia Imperiale, dipendente dall'Università di Parigi, col compito di sovrintendere all'intero sistema scolastico toscano.

Lo Studio riprese ad essere autonomo con la Restaurazione, quando, per volontà di Cosimo Ridolfi, fu creato l'Istituto di Agraria, fu istituita la prima cattedra di veterinaria e fu avviata la pubblicazione di numerose riviste scientifiche. Scienziati prestigiosi insegnarono a Pisa tra la seconda metà dell'Ottocento e gli inizi del Novecento: tra questi Giovan Battista Amici, Enrico Betti, Ulisse Dini, Antonio Pacinotti e Luigi Bianchi. Nel 1839 fu sede del primo Congresso degli Scienziati Italiani.

L'Università di Pisa conserva, nel seicentesco Palazzo Lanfreducci, detto "Alla giornata", sede del Rettorato, una piccola ma significativa collezione di strumenti scientifici, comprendente quattro importanti globi secenteschi, celesti e terrestri, opera di Willem Jansz Blaeu, e un significativo barometro a quadrante della metà del secolo XVIII.