La prima notizia sull'istituzione risale al 1240: da un documento del tempo si apprende dell'esistenza di uno Studio "provinciale", finanziato dal Comune, costituito dalle scuole di diritto, di grammatica e di medicina. Il 16 agosto del 1357 l'imperatore Carlo IV di Lussemburgo rilasciava il diploma nel quale disponeva, andando incontro alle richieste avanzate dal governo dei Dodici, che sorgesse a Siena uno Studium Generale «in iure civili et canonico et medicinis, philosophia, loyca, gramatica et quavis alia facultate» nel quale i docenti avessero il potere di conferire tutti i gradi accademici sotto la supervisione del vescovo o, in sua assenza, del capitolo della Chiesa senese. Per le numerose chiusure e sospensioni delle lezioni, l'istituzione cominciò ad avere un'esistenza regolare solo dal 1400. Con l'annessione dello Stato senese al Ducato di Firenze e in seguito alla riforma costituzionale del 1561, lo Studio fu dotato di nuovi insegnamenti. Durante il Granducato di Ferdinando I fu istituita la prima cattedra di lingua toscana presso un'Università italiana e attivata quella di «medicamenti semplici», ossia di erbe "medicinali".

Nel 1738 l'economista Pompeo Neri fu incaricato dal governo lorenese di "formare un piano" per sviluppare l'Università sotto il profilo organizzativo e culturale. La riforma, proposta nel 1743, fu applicata solo nel 1759, quando gli fu affidato un secondo incarico per risanare lo Studio. Neri propose una riforma intesa ad accrescerne il livello scientifico. Nel 1741, per rinnovare l'insegnamento anatomico dello Studio con l'introduzione del metodo sperimentale, aveva fatto chiamare il medico riminese Giovanni Bianchi; aveva inoltre reso obbligatoria l'iscrizione dei docenti all'Accademia dei Fisiocritici per creare una stretta collaborazione scientifica con quell'istituzione.

Con decreto del 1808 lo Studio senese fu trasformato in Scuola di Medicina dipendente dall'Università di Pisa e solo nel 1814 fu nuovamente riaperto. Con motuproprio del 1851 l'istruzione superiore del Granducato fu riorganizzata in una sola Università toscana, chiamata Studio Etrusco, e suddivisa nelle sedi di Pisa e Siena. A Siena rimasero solo due facoltà, giurisprudenza e teologia, mentre a Pisa rimasero attivate le facoltà di Filosofia e Filologia, Medicina e Chirurgia, Scienze Matematiche e Scienze Naturali.

Con l'annullamento del decreto del 1851 furono nuovamente attivate a Siena la facoltà di Medicina e Chirurgia. Il 27 ottobre 1859 fu introdotta presso lo Studio l'innovazione dei concorsi a cattedra, che avrebbe dovuto garantire migliori docenti, in grado di fare concorrenza a quelli dello Studio Pisano. Tale scelta, che sarebbe stata attuata qualche decennio più tardi dallo Studio di Napoli, garantiva l'acquisizione dei docenti non più per scelta del sovrano, ma attraverso un concorso. Su diciassette cattedre di Legge, sedici di Arti e medicina e una di Teologia, la Riforma stabilì che rimanessero "ad arbitrio" del sovrano le prime di medicina teorica e pratica, di diritto civile, di matematica, di lingua toscana, di "Umanità" (lingua e letteratura greca e latina) e di "Semplici". Classificata nella legge Matteucci del 1862 come università secondaria, l'Ateneo senese conta attualmente otto facoltà in sede e una Facoltà di lettere e filosofia ad Arezzo.