Questa sala presenta esclusivamente strumenti italiani, alcuni dei quali costruiti nelle botteghe medicee, come i dispositivi firmati da Baldassarre Lanci, da Ignazio Danti e da Giovanni Battista Giusti. Questa sala testimonia l'impegno del casato mediceo per dotare il Granducato delle competenze tecniche necessarie alla realizzazione di strumenti scientifici. Particolare rilievo riveste la produzione di una dinastia di artefici e orologiai toscani, i della Volpaia, che rimase attiva tra Firenze, Roma e Venezia per molte generazioni. La qualità raggiunta dagli artefici italiani del Cinquecento e del Seicento nella costruzione di strumenti di precisione, quali astrolabi, quadranti, orologi solari e notturni, è attestata anche dai raffinati prodotti di costruttori di altre regioni della penisola, tra i quali vanno segnalati Antonio Bianchini e i Lusverg.