Costruito intorno al 1440 da Luca Fancelli su progetto di Filippo Brunelleschi per il mercante Luca Pitti, fu acquistato con il terreno retrostante nel 1549 da Cosimo I de' Medici per la moglie Eleonora di Toledo. Nel 1549 Buontalenti ebbe da Cosimo I l'incarico per la realizzazione dell'annesso Giardino di Boboli progettato da Tribolo. I lavori di ampliamento dell'edificio, affidati dal 1560 all'architetto fiorentino Bartolomeo Ammannati, miravano a trasformare il palazzo rinascimentale di Luca Pitti in una reggia. L'intervento dell'Ammannati si concentrò nel grande cortile, vera e propria piazza reale porticata. Nel cantiere di Pitti, Bartolomeo Ammannati portò le proprie competenze teorico-pratiche, che celebrò nel rilievo della Mula. Protagonista di questo singolare monumento al cantiere del cortile di Pitti è, come recita il cartiglio, l'umile animale da carretta raffigurato in primo piano, in attesa di sollevare uno dei capitelli del cortile. Nel rilievo compaiono anche l'uomo e la macchina: quest'ultima è rappresentata, a destra, da una gru costituita da un lungo palo munito di carrucole e funi, a sinistra, da un argano che l'uomo si appresta a smontare e che veniva azionato dall'animale. Si tratta di una macchina fondamentale nei cantieri dell'epoca, destinata a sollevare grandi pesi.

Nel 1553 Palazzo Pitti divenne dimora ducale, ampliata e modificata a varie riprese fino al 1783. Intorno alla metà del secolo XVI Cosimo I vi iniziò a raccogliere preziose collezioni d'arte e di produzioni naturali, oggi conservate nei maggiori musei fiorentini. Negli anni in cui Firenze fu Capitale del Regno d'Italia divenne l'abitazione ufficiale dei Savoia. Attualmente è sede della Galleria Palatina, istituita dal Granduca Leopoldo II nel 1828, della Galleria d'Arte Moderna, della Galleria del Costume e del Museo degli Argenti. Fanno parte del complesso museale di Pitti il Museo delle Porcellane e il Museo delle Carrozze. All'interno del Palazzo è ancora oggi conservata una meridiana, realizzata nel 1696, durante il Granducato di Cosimo III, nella palazzina che ne prende il nome. Presenta un quadrante verticale ed orizzontale ed è coordinata per la funzione oraria e calendariale, fornendo indicazioni relative al giorno e al mese. Tuttora integra, la meridiana non è però più funzionante, in quanto la successiva costruzione al piano superiore di una loggia impedisce al Sole di illuminare il foro gnomonico.

Nel corso del secolo XVII, Palazzo Pitti fu anche la sede privilegiata di importantissime riunioni scientifiche. Sin dal 1640 il Granduca Ferdinando II de' Medici era solito riunirvi alcuni scienziati con lo scopo di compiere osservazioni naturali. A queste riunioni parteciparono, oltre allo stesso Granduca, anche Evangelista Torricelli e Vincenzo Viviani. Da tali sedute prese origine l'Accademia del Cimento che, fondata nel 1657 dal principe Leopoldo de' Medici e dal Granduca Ferdinando II de' Medici, fu la prima società a carattere scientifico costituitasi in Europa. Ebbe come scopo primario lo sviluppo e la diffusione della metodologia sperimentale galileiana nel campo delle scienze naturali. L'attività dell'Accademia prevedeva una verifica rigorosamente sperimentale dei principi della filosofia naturale, sostenuti fino ad allora in base all'autorità di Aristotele. "Provando e riprovando" fu il motto che seppe ben contraddistinguere l'impresa del Cimento. Le riunioni dell'Accademia si tennero con periodicità discontinua per un decennio nell'appartamento del principe Leopoldo de' Medici. Nel 1667 l'Accademia pose fine alla sua attività, con la pubblicazione dei Saggi di Naturali Esperienze, in cui vennero presentati i principali risultati conseguiti dai suoi membri. Nel 1801 si tentò di riportare in vita l'Accademia del Cimento, ma l'esperienza, nata con una certa enfasi celebrativa, ebbe termine dopo soli 10 giorni. Nell'Istituto e Museo di Storia della Scienza sono oggi conservati gli strumenti da esperienza utilizzati dagli accademici per le loro osservazioni naturali.