Giovanni Gualberto, monaco di San Miniato, giunse a Vallombrosa nel 1036. La foresta di castagni, abeti bianchi e faggi divenne subito meta di pellegrinaggio di chierici e laici, attratti dalla rigida vita monastica condotta e predicata da Giovanni Gualberto. Già nel 1039 la badessa Itta donava il terreno per costruire il monastero e la chiesa, consacrata nel 1051, mentre nel 1055 Papa Vittore II riconosceva la Congregazione benedettina di Vallombrosa.

Ricostruito intorno alla metà del Quattrocento dall'abate Francesco Altoviti, il monastero si arricchì notevolmente nel corso dei secoli, diventando tra i secoli XVII e XVIII un importante punto di riferimento per la cultura scientifica toscana. Intorno al 1578 sembra vi abbia soggiornato, per volontà del padre, Galileo Galilei, forse in qualità di novizio.

I vallombrosani condussero osservazioni meteorologiche per la rete meteorologica medicea (1654-1667), la prima istituita in Europa. Alla Biblioteca Nazionale Centrale di Firenze sono conservati alcuni documenti (segnati "Strumenti di Vallombrosa negli anni '60 del XVII secolo da alcuni monaci, tra cui don Filiberto Casini e don Antonio Petreschi"), in cui si annotano le condizioni climatiche: «Continua il vento; grandissimo diaccio nel vivaio... nuvolo, vento, diaccio...».

Importanti furono anche le ricerche botaniche. Da segnalare, tra Seicento e Settecento, l'attività di Virgilio Falugi e soprattutto di Bruno Tozzi, amico del grande botanico Pier Antonio Micheli e corrispondente dei maggiori botanici europei. Tozzi e altri monaci studiarono e raffigurarono con estrema perizia le essenze vegetali della regione.

Dopo la soppressione napoleonica del 1808, il monastero fu ripristinato nel 1815 per passare allo Stato nel 1866 come sede dell'Istituto Forestale Nazionale. I monaci benedettini tornarono a Vallombrosa solo dopo la Seconda Guerra Mondiale.