La Biblioteca ebbe origine dal fondo librario di Antonio Magliabechi, costituito da circa 30.000 volumi e lasciato, nel 1714, alla città di Firenze. Nel 1737 l'amministrazione granducale stabilì che vi fossero depositate le opere edite a Firenze e, nel 1743, estese il precetto a quelle edite in tutta la Toscana. La Biblioteca fu aperta al pubblico nel 1747. Nel 1774 le fu assegnata parte della biblioteca del medico Antonio Cocchi. Consistenti incrementi pervennero a seguito delle soppressioni degli enti ecclesiastici. Nel 1861 le venne accorpata la Biblioteca Palatina, costituita dal Granduca Ferdinando III di Lorena. Nel 1885 assunse il nome di Biblioteca Nazionale e, nel 1875, l'appellativo di Centrale. Dal 1870 ha il diritto di stampa sul territorio nazionale. La Biblioteca, originariamente ospitata nel palazzo della Dogana, attiguo agli Uffizi, fu trasferita nel 1935 nella sede attuale, appositamente costruita. Gravi danni furono causati dall'alluvione del 1966: una parte del patrimonio andò perduto o danneggiato. A seguito dell'evento fu istituito il Centro per il Restauro ancora oggi attivo. La Biblioteca pubblica la Bibliografia Nazionale Italiana ed è sede pilota per l'istituzione del Servizio Bibliotecario Nazionale.

Tra i manoscritti, vi è la preziosa Collezione galileiana e la Raccolta Targioni Tozzetti. Il nucleo principale della Collezione Galileiana, appartenuto a Giovanni Battista Clemente de' Nelli, fu acquistato, nel 1818, da Ferdinando III. Accresciuta di ulteriori manoscritti galileiani, provenienti da biblioteche, archivi e raccolte di privati, ebbe un primo ordinamento da parte dello stesso Granduca. Riordinata da Vincenzo Antinori, la Collezione, costituita da 307 volumi, si articola in cinque sezioni: la prima raccoglie i documenti appartenuti a Vincenzo Galilei; la seconda comprende i manoscritti di Galileo Galilei; la terza sezione possiede alcuni documenti di contemporanei dello scienziato; la quarta conserva i codici di Benedetto Castelli, Bonaventura Cavalieri, Evangelista Torricelli e Vincenzo Viviani, mentre la quinta le carte appartenute all'Accademia del Cimento.

La Raccolta Targioni Tozzetti comprende i manoscritti di Targioni Tozzetti, che entrarono a far parte del patrimonio dalla Biblioteca Nazionale in tempi diversi. Il primo nucleo fu acquistato per la Biblioteca Palatina dal Granduca Leopoldo II nel 1851. Il secondo nucleo, costituito dai manoscritti di Giovanni, Ottaviano e Antonio Targioni Tozzetti, e dalle carte di Pier Antonio Micheli, compreso l'erbario Micheli-Targioni, fu venduto alla Biblioteca Nazionale nel 1894. Le miscellanee della biblioteca Targioni e le opere a stampa dei Tozzetti furono acquistate dalla Magliabechiana nel 1857. L'intera collezione raccoglie accanto a testi di botanica, mineralogia, biologia, geologia, chimica, agricoltura e medicina, anche opuscoli di letteratura, memorie di viaggio ed autografi di personaggi illustri.

La Biblioteca conserva raccolte sette-ottocentesche di piante essiccate, provenienti dai fondi manoscritti degli ordini monastici soppressi tra i secolo XVIII e XIX. Presenta inoltre una coppia di globi (celeste e terrestre), realizzati dal cosmografo veneziano Vincenzo Coronelli nel 1696, dedicati a Guglielmo III d'Orange, re d'Inghilterra.

Emblemi della scienza si trovano anche all'esterno della Biblioteca. Su una delle torrette della facciata (a destra di chi guarda), si trova la statua di Galileo Galilei che sorregge il cannocchiale. Sempre sulla facciata, si trovano una serie di medaglioni dedicati a personaggi famosi. Fra questi, quello di Leonardo da Vinci e ancora di Galileo.