Fu fondato nel 1385, per volere di Lemmo Balducci, nel convento delle Monache di San Niccolò, trasferite da quel momento nella vicina via Alfani. Scopo dell'Istituzione era quello di accogliervi gli infermi poveri sotto la direzione e il patronato della Corporazione dell'Arte del Cambio al cui santo protettore, San Matteo, l'ospizio fu dedicato. L'assistenza agli ammalati (che vi furono accolti a partire dal 1410) era garantita da volontari che esercitavano gratuitamente il proprio servizio, mentre l'amministrazione dell'ospedale era affidata a rettori, detti spedalinghi, appartenenti all'ordine sacerdotale.

Poco oltre la metà del Settecento vi furono effettuati i primi esperimenti di vaiolizzazione mediante l'inoculazione del virus del vaiolo a bambini provenienti dal vicino Ospedale degli Innocenti: queste prime vaccinazioni venivano eseguite allo scopo di sperimentare l'opportunità di adottare tale metodo nella cura della malattia. L'Ospedale di San Matteo fu soppresso nel 1784, insieme a molti altri piccoli ospedali, ed i suoi beni furono incamerati dall'Ospedale di Santa Maria Nuova.

Nei locali dell'ex chiesa dell'Ospedale di San Matteo si trova, dal 1851-1853, la Biblioteca dell'Accademia Fiorentina di Belle Arti.