In occasione del IV centenario della morte di Leonardo (1919) prese forma l’idea di consacrare al genio vinciano un museo che, nella sua patria, ne illustrasse l’opera. Come sede espositiva fu scelto il Castello dei Conti Guidi, donato dal conte Giulio Masetti da Bagnano al Comune. Prima che il museo aprisse i battenti passò, però, del tempo poiché l’inaugurazione, avvenuta a seguito di radicali restauri dell’edificio protrattisi dal 1939 al 1942, ebbe luogo soltanto nel 1952, in occasione del V centenario della nascita di Leonardo. A questa data il percorso espositivo era costituito da una serie di macchine ispirate ai suoi disegni. Negli anni Ottanta la Biblioteca Leonardiana, ospitata fino ad allora nel Castello, si trasferì nella sede attuale, mentre il museo, con una iniziativa avveniristica per l’epoca, ampliò l’esposizione con modelli realizzati da IBM Italia e presentati prima della loro definitiva sistemazione a Vinci in una mostra itinerante dal titolo "Laboratorio su Leonardo". Il percorso espositivo vero e proprio si articola in due sedi: il già ricordato Castello dei Conti Guidi, nella cui sala del Podestà è ospitata una pregevole Madonna robbiana, e la Palazzina Uzielli, affacciata su Piazza Guidi dove spicca l’installazione dell’artista Mimmo Paladino.

É proprio da qui che ha inizio il percorso di visita; nelle sale della Palazzina sono, infatti, ospitate macchine tessili e da cantiere, il cui funzionamento è illustrato anche grazie a ricostruzioni virtuali. Il percorso espositivo, concepito per illustrare le conoscenze scientifiche, teoriche ed empiriche del Rinascimento, si presta ottimamente ad essere integrato con le mostre temporanee di analogo soggetto periodicamente organizzate e con i laboratori didattici che qui si svolgono. Nelle sale del Castello dei Conti Guidi si trovano, invece, modelli relativi ai numerosi altri campi d’indagine nei quali si esercitò l’infaticabile spirito di osservazione leonardesco. È qui che il visitatore potrà vedere le ricostruzioni delle macchine avveniristiche per volare, per muoversi sull’acqua o sulla terra che tanto hanno contribuito alla fama di Leonardo: l’"elicottero", la macchina volante, il carro automotore (o "automobile") e molti altri ancora. Non meno interessanti sono le riproduzioni degli strumenti scientifici descritti da Leonardo nei suoi manoscritti, fra i quali l’equalizzatore, il riflettore e il pignone a cremagliera.