L'Opera di Santa Maria del Fiore sorse con la fondazione della nuova Cattedrale nel 1296 e nel 1331 l'amministrazione passò all'Arte della Lana. Fin dalle origini l'Opera fu un'istituzione laica e indipendente, con l'incarico di curare il patrimonio della Cattedrale. Da allora provvede alla salvaguardia del complesso e, per convenzione con il Capitolo della Metropolitana Fiorentina, sopperisce alle spese per il culto. Nel 1777 un decreto granducale affidò all'Opera anche il Battistero e diversi altri fabbricati. Con il Concordato del 1929 l'Ente ha assunto lo status di Fabbriceria.

Nel 1891 fu istituito il Museo allo scopo di conservare i manufatti non collocati nella Cattedrale e i diversi oggetti residuati dal cantiere. Nel 2001 il Museo è stato ristrutturato e le collezioni riallestite. Tra i beni scientifici, di cui l'Opera ha responsabilità, figurano anche il medievale marmo solstiziale del Battistero, l'orologio meccanico, gli gnomoni della Cattedrale e vari materiali utilizzati per esperimenti sulla rotazione della Terra nell'Ottocento.

La collezione comprende diversi attrezzi di cantiere (argani, carrelli, canapi ecc.) e strumenti scientifici, databili a partire dal Medioevo, esposti nella sala del "Cantiere brunelleschiano" del Museo, insieme a modelli in legno della Cattedrale.

All'ultimo piano del Museo è collocata la sala didattica per non vedenti, che contiene riproduzioni di opere e modelli da percepire con il tatto.