Fu istituito ufficialmente nel 1842 quando Filippo Parlatore allestì nel Museo di Fisica e Storia Naturale l'Herbarium Centrale Italicum, prima raccolta botanica nazionale di campioni d'erbario. Nel 1854 fu acquisito il grande erbario del viaggiatore e botanico inglese Philip Barker Webb, costituito da molti campioni dei secoli XVIII e XIX provenienti dall'Africa, dall'America Meridionale e dall'Oceania. Alla fine dell'Ottocento il Museo fu trasferito nei locali di via La Pira, dove si arricchì di nuove acquisizioni (Erbario Beccari della Malesia e Erbario Libico). Attualmente il Museo Botanico è il primo in Italia, sia per la mole delle collezioni (circa 4 milioni di campioni), sia per il loro valore scientifico.

La collezione degli erbari comprende: Herbarium Centrale Italicum (sezione fanerogamica e crittogamica, 3.600.000 reperti in tutto), Erbario Webb (300.000 reperti), Erbario Beccari della Malesia (16.000 reperti), Erbario Micheli-Targioni Tozzetti (19.000 reperti), Erbari storici (Cesalpino, Merini e altri: 2.000 reperti).

La collezione di cere botaniche, realizzata prevalentemente tra la fine del Settecento e la metà dell'Ottocento da famosi ceroplasti come Francesco Calenzuoli, Luigi Calamai ed Egisto Tortori, è composta da modelli di piante e di frutti a grandezza naturale (466 reperti, di cui una piccola parte realizzata in gesso o cartapesta) e preparati su tavola riguardanti l'anatomia, la fisiologia e la patologia vegetale (38 tavole). Il Museo comprende anche quadri del Sei-Settecento di soggetto botanico del pittore mediceo Bartolomeo Bimbi e di Filippo Napolitano, oltre a copie settecentesche delle opere del Bimbi (circa 50 quadri).

La collezione botanica comprende la palinoteca (400 reperti in provetta e preparati microscopici), la xiloteca (7.000 reperti), la carpoteca (16.000 reperti a secco e in alcool), la spermoteca (240 reperti in provette), oltre a fossili vegetali (10.000 reperti circa).