Il Museo, che oggi fa parte della Galleria dell'Accademia, conserva un'antica e preziosa raccolta di strumenti musicali, databili tra il 1568 e il secolo XX, il cui nucleo originario risale agli acquisti effettuati dalla Corte medicea. I fastosi balli di corte, i concerti e i primi spettacoli melodrammatici, nati proprio a Firenze nel 1600 nell'ambito della Camerata de' Bardi (ne faceva parte anche Vincenzo Galilei, padre di Galileo), suscitarono nei principi medicei un'attenzione particolare nell'acquisto di strumenti tecnicamente sempre più perfezionati, patrocinando l'attività di liutai ed organari. Ne è un esempio il celebre Bartolomeo Cristofori che, chiamato a Firenze, realizzò nel 1698 il primo pianoforte di cui però non resta che la descrizione dello stesso Cristofori. Tra gli strumenti più importanti del Museo si segnalano violini, viole e violoncelli di Antonio Stradivari, un violoncello Amati, il pianoforte verticale di Domenico Del Mela, la spinetta Floriani; tra gli strumenti a fiato il flauto Giorgi, il flauto Briccialdi e un bimbonifono, ovvero un trombone dotato di una meccanica che consentiva anche agli strumenti a bocchino più gravi di effettuare particolari virtuosismi come legati, trilli, ecc., ideato da Giovacchino Bimboni tra il 1849 e il 1870. Arricchitasi nel tempo da nuove acquisizioni, nel 1863 la collezione fu trasferita da Palazzo Pitti al Conservatorio di Musica "L. Cherubini" dove fu inaugurata nel 1926.

Il Museo espone circa cinquanta strumenti musicali provenienti dalle collezioni private dei granduchi di Toscana, Medici e Lorena, raccolti tra la seconda metà del secolo XVII e la prima metà del XIX e passati successivamente al Conservatorio Cherubini di Firenze, che dal 1996 li ha concessi in comodato alla Galleria dell'Accademia. Tra questi spiccano: la viola tenore di Antonio Stradivari, il violoncello che faceva parte dello stesso quintetto realizzato nel 1690 per il Gran Principe Ferdinando, un violino di Stradivari del 1716 e un violoncello di Niccolò Amati del 1650.

Nel museo sono inoltre esposti due strumenti di Bartolomeo Cristofori, inventore del pianoforte e il più antico pianoforte verticale oggi conservato. Gli strumenti sono presentati insieme a dipinti raffiguranti scene della vita musicale della corte medicea. Una serie di computer permette di ascoltare il suono di tutti gli strumenti esposti e di avere informazioni sulla cultura musicale della Firenze Granducale. Il museo fa parte della Galleria dell'Accademia.