Fondato nel 1288 da Folco Portinari, padre della Beatrice di Dante Alighieri, rappresentò un precoce ed efficace esempio di assistenza sanitaria in Italia e in Europa. Sotto i governi medicei raggiunse uno sviluppo notevole. L'amministrazione dell'Ospedale di Santa Maria Nuova era affidata a rettori, detti spedalinghi. Il 17 novembre 1783, con decreto granducale, Pietro Leopoldo di Lorena approvò un regolamento ospedaliero, il primo introdotto ufficialmente in Toscana, di carattere politico ed economico, per contenere le spese eccessive e correggere le irregolarità. Gli artefici principali furono il commissario granducale Marco Covoni e Vincenzo Chiarugi, che svolsero una verifica accurata della situazione interna agli ospedali e agli istituti di beneficenza del Granducato.

Sin dal Quattrocento, all'Ospedale era annesso un giardino dove venivano coltivate le piante officinali. La funzione principale di questo "giardino dei semplici" era quella di rifornire la Spezieria, anch'essa attestata presso l' Ospedale sin dal secolo XV. Il primo catalogo delle piante dell'Orto, redatto dal direttore Giuseppe Baldi, risale alla metà del Seicento. Agli inizi del secolo XVIII l'attività di Sebastiano Franchi, Niccolò Gualtieri e Gaetano Moniglia consentì all'Orto un notevole sviluppo, cui contribuì ulteriormente l'abate Giovanni Lapi di Borgo San Lorenzo, "lettore" di Botanica nella Scuola di Medicina e Farmacia. Alla fine del secolo l'Orto conobbe un lento declino, nonostante la direzione di Antonio Targioni Tozzetti e del figlio Adolfo Targioni Tozzetti, che lo guidò fino al 1860. Nel 1881 fu definitivamente soppresso.

Nel 1688 fu costruito all'interno dell'Ospedale uno "spedaletto" da destinarsi a "pazzeria", nel quale venivano prevalentemente accolti quei pazienti poveri, di sesso maschile, che non potevano pagare la retta prevista per il ricovero al vicino ospedale di Santa Dorotea, detto "de' Pazzerelli". Dal 1729 furono accolte nella Pazzeria anche le donne, ma nel 1780, con l'apertura di reparti specializzati, i malati di mente furono tutti trasferiti all'Ospedale di Bonifazio.

Strettamente legata alla storia dell'Ospedale è quella dell'annessa Scuola di Chirurgia. Accoglieva giovani che aspiravano a diventare medici, chirurghi o speziali. La caratteristica di questa scuola ospedaliera fu essenzialmente pratica, con lezioni svolte direttamente al capezzale dei pazienti ed osservazioni sui cadaveri. Nel 1785 la Scuola si arricchì di un prezioso strumentario chirurgico donato da Pietro Leopoldo. Successivamente, attraversò un grande periodo di floridezza grazie all'opera di Paolo Mascagni. Con la restaurazione dei Lorena, nel 1840 fu dato l'assetto definitivo a quella che sarà la Scuola di Completamento e Perfezionamento degli Studi Pratici Medico Chirurgici dell'Arcispedale di Santa Maria Nuova. La sua attività terminò nel 1859 quando la legge Casati la inserì nell'Istituto di Studi Superiori e di Perfezionamento del Regno d'Italia. Tra i molti insegnamenti attivi presso la Scuola di Chirurgia meritano particolare attenzione quelli di Anatomia Patologica, Malattie Mentali e Ostetricia.

A Firenze l'Ostetricia, originariamente insegnata dai cosiddetti "Chirurghi delle donne", ebbe la sua prima cattedra nel 1756 quando il Granduca Francesco Stefano nominò Giuseppe Vespa maestro di grembiule dell'Ospedale di Santa Maria Nuova ed operatore di parti. A partire dal 1773, nell'Ospedale fu attivato un locale per partorienti povere destinato da Pietro Leopoldo all'istruzione pratica delle ostetriche del Granducato. Nel 1783 la Clinica di Ostetricia sostituì la vecchia scuola di istruzione ostetrica situata presso l'Ospedale dell'Orbatello. Dal 1806 Giuseppe Galletti si occupò dell'istruzione pratica dei chirurghi e delle ostetriche, utilizzando modelli in cera a scopo didattico. Negli anni successivi fu mantenuta la separazione tra la parte pratica e teorica dell'insegnamento: così, mentre nell'Ospedale degli Innocenti si svolgevano le esercitazioni pratiche, al Santa Maria Nuova venivano tenute le lezioni teoriche.