Lo Studium generale nasce per delibera del Comune di Firenze nel 1321. Nel 1324, dopo soli tre anni di vita, fu costretto a cessare la sua attività, che tuttavia riprese nel 1349, con sede nell'attuale via "dello Studio". Nel 1387, dopo una ulteriore interruzione, furono promulgati nuovi statuti: venne istituita la prima cattedra in Europa di greco e dato un maggiore impulso alla medicina, per le cui lezioni di anatomia il comune aveva messo a disposizione due cadaveri. Nel 1473 con la riapertura dello Studio pisano e il trasferimento a Pisa dello Studium generale, dello Studio fiorentino rimase solo il Collegio teologico, con gli insegnamenti umanistici. Nel 1497 si arricchì delle cattedre scientifiche dello Studio di Pisa, temporaneamente trasferito a Firenze, dove rimase fino al 1505. Risale al 1500 il primo insegnamento di matematica tenuto nello Studio fiorentino da Luca Pacioli. Nel 1571 fu chiamato a ricoprire la cattedra di matematica Egnazio Danti, al quale subentrò nel 1586 Ostilio Ricci, che ebbe il merito di istruire nella geometria il giovane Galileo. Nel 1642, a ricoprire la cattedra di matematica fu chiamato Evangelista Torricelli, al quale subentrò, alla sua morte, avvenuta nel 1647, Vincenzo Viviani. Le letture di botanica negli anni dell'ultimo granducato mediceo e del primo governo lorenese furono tenute prima da Pier Antonio Micheli, poi, dal 1737, da Giovanni Targioni Tozzetti.

A Firenze la diffusione della cultura avvenne attraverso istituzioni parallele allo Studio fino agli anni dell'Unità d'Italia, quando, nel 1859, durante il governo provvisorio di Bettino Ricasoli, venne creato l'Istituto di Studi Superiori da cui prenderà corpo l'attuale Università. L'Istituto di Studi Superiori Pratici e di Perfezionamento ereditava e proseguiva l'attività del Liceo di Scienze Fisiche e Naturali, inserendosi nella grande tradizione culturale fiorentina. Le finalità dell'Istituto, come chiaramente indicava il nome, erano, da un lato, il perfezionamento per coloro che avevano terminato gli studi universitari e, dall'altro, la pura ricerca scientifica. Allo stesso tempo, l'Istituto proponeva un coordinamento fra gli studi scientifici e quelli umanistici. Era, infatti, composto da tre sezioni: Medicina e Chirurgia, Scienze Naturali, Filosofia e Filologia. Inizialmente fu istituita anche una sezione di Scienze Giuridiche, che tuttavia ebbe breve durata. Nel 1872 fu approvata dal parlamento nazionale una convenzione che ne consentiva una riorganizzazione ed un ampliamento, assumendo sempre più una fisionomia universitaria. Infatti negli anni seguenti le sezioni furono configurate come vere e proprie facoltà e, nel 1923, l'Istituto si trasformò in Università degli Studi di Firenze. Nel novembre del 1924 fu inaugurato il primo anno accademico dell'Università di Firenze.

Tra gli apparati decorativi del Rettorato dell'Università in piazza San Marco si segnala una statua di Galileo Galilei.