La villa fu fatta edificare da Ferdinando I nel 1587, probabilmente su disegno di Bernardo Buontalenti, che la costruì sulle fondamenta di un palazzo preesistente. L'imponente mole è caratterizzata da quattro torri agli angoli dell'edificio, che la configurano come villa-fortilizio. Situata presso la confluenza del Pesa con l'Arno, costituiva un luogo di sosta negli spostamenti della Corte tra Firenze e Pisa, oltre ad essere casino di caccia dei granduchi. Notevole era anche il giardino, arricchito da scenografici giochi d'acqua.

Nei mesi di marzo e aprile 1681 il grande scienziato aretino Francesco Redi studiò, proprio presso la villa medicea dell'Ambrogiana, l'apparato genitale della lepre femmina attraverso numerose anatomie. Di particolare rilevanza, da un punto di vista dell'iconografia storico-scientifica, la collezione di dipinti di soggetto botanico e zoologico che il Granduca Cosimo III de' Medici commissionò a Andrea Scacciati e a Bartolomeo Bimbi per arricchire la villa.

Verso la metà dell'Ottocento, dopo oltre due secoli di storia gloriosa, il Granduca Leopoldo II la destinò a casa di cura per malattie mentali. Fu poi carcere femminile e minorile e, nel 1886, fu decisa la conversione in Ospedale Psichiatrico Giudiziario. L'edificio non è dunque accessibile, anche se in alcuni periodi dell'anno vengono organizzate visite guidate che permettono di ammirarne alcune sale, il chiostro, la cappella e il giardino. Fuori dal perimetro della villa è stato realizzato un bel parco urbano.