L'Istituto fu fondato nel 1419 dall'Arte della Seta per accogliere l'infanzia abbandonata. Il progetto per la costruzione dell'edificio fu affidato a Filippo Brunelleschi, il quale realizzò uno dei più importanti complessi edilizi dell'architettura rinascimentale. Dal 1445, quando fu ufficialmente inaugurato e fu lasciata la prima bambina, l'Istituto non ha mai cessato la sua attività, adattandola al mutare dei tempi. I bambini venivano abbandonati in una specie di pila dell'acqua santa, posta alla destra del loggiato; nella seconda metà del secolo XVII la pila fu sostituita con una "rota", ossia una pietra girevole posta all'estremità opposta del loggiato, che rimase in funzione sino alla seconda metà del secolo XIX. I bambini, allattati da balie esterne all'istituto, successivamente venivano affidati a famiglie della provincia (per lo più contadine) che li allevavano dietro compenso. La tutela fisica e morale garantita ai "gettatelli" si protraeva fino all'età di 18 anni per i maschi, mentre alle femmine veniva offerta ospitalità fino al momento del matrimonio, provvedendo anche alla dote necessaria. Nel 1815, per volontà di Ferdinando III venne istituito, in locali attigui all'Ospedale, un Ospizio di Maternità cui si affiancò una cattedra destinata alla formazione professionale delle ostetriche. L'insegnamento di discipline ostetriche, già attivo presso la Scuola di Ostetricia, fu così suddiviso in Ostetricia teorica (con sede nell'Ospedale di Santa Maria Nuova) e Ostetricia pratica (con sede nell'Ospedale degli Innocenti).

L'Istituto, dotato di un laboratorio che produceva vaccini per tutta la Toscana, si distinse anche nell'opera di diffusione delle vaccinazioni, avviata a partire dalla fine del Settecento e riconosciuta dal Granduca negli anni Trenta dell'Ottocento. Oggi è un'istituzione pubblica con un consiglio di amministrazione, il cui Presidente è eletto dalla Regione Toscana. Conserva una collezione di circa sessanta strumenti medici e di laboratorio dei secoli XIX e XX.

L'importanza di questo istituto nel campo della storia della sanità e dell'arte è testimoniato da un importante archivio e dalle opere custodite nel Museo dello Spedale, posto nel salone sovrastante il loggiato brunelleschiano.

Oggi l'Istituto, oltre a continuare la sua tradizione come centro di assistenza per l'infanzia, l'adolescenza e la famiglia, è anche un centro di documentazione, ricerca, analisi e formazione.