Il 15 febbraio 1564 Galileo nacque a Pisa da Vincenzo Galilei, maestro di musica fiorentino d'origine, e da Giulia Ammannati, di famiglia pesciatina stabilitasi a Pisa anni addietro, in casa dello zio Leone Ammannati, pertinenza della cappella di S. Andrea forisportam, come si evince dall'atto di battesimo, stilato il 19 febbraio nel Battistero di Pisa.

Costretto a stabilirsi a Firenze forse anche per svolgere, parallelamente a quella di musicista, un'attività mercantile, Vincenzo Galilei lasciò la famiglia a Pisa sotto la tutela dell'amico e futuro parente Muzio Tedaldi, che avrebbe in seguito sposato la nipote di Giulia. Il piccolo Galileo ebbe perciò la prima istruzione elementare presso la scuola pubblica della comunità di Pisa, che assumeva con impegni triennali un maestro "di scrivere", uno di grammatica e uno d'abbaco, obbligandoli per contratto a trovare una sede idonea e, secondo un documento conservato presso l'Archivio di Stato di Pisa, ad insegnare «a tutti egualmente tanto al povero quanto al riccho cittadino». Forse Galileo apprese allora anche i primi rudimenti del greco, dato che Antonio Leonardi da Castiglione, uno dei maestri di grammatica che insegnò nel periodo della sua frequenza scolastica, compresa verosimilmente fra il 1569 e il 1574, ebbe (e fu uno dei pochi) anche l'incarico di magister literarum graecarum.

Verso la fine del 1574 Galileo si trasferì a Firenze per raggiungere il padre, che aveva lasciato Pisa già da qualche tempo. Vi trascorse alcuni anni proseguendo la propria istruzione e perfezionandosi tanto negli «studii d'umanità, lingua greca e dialettica», quanto nel disegno e nella musica (pare fosse abile suonatore di liuto). A detta di Niccolò Gherardini, biografo a dire il vero poco informato sugli anni giovanili, fu mandato «alla scuola di grammatica appresso d'un tal professore, huomo assai dozzinale, che insegnava in una casa di propria abitazione posta in via de' Bardi». E la famiglia Galilei abitava forse non lontano, perché in calce a una lettera di Muzio Tedaldi indirizzata al padre si legge: «data a Pier Francesco Lapini, di contro al monte de' Torrigiani», corrispondente alla collina retrostante a Palazzo de' Mozzi in Oltrarno, attiguo, appunto, alla via de' Bardi.

In seguito proseguì gli studi presso i monaci vallombrosani, non è chiaro se proprio nel monastero di Vallombrosa o nella comunità di Santa Trinita, come sostiene il Viviani, entrando nell'ordine, parrebbe, addirittura come novizio. Appartengono a questo periodo alcuni appunti autografi riguardanti la logica aristotelica, probabilmente esemplati sulle lezioni tenute dai Gesuiti del Collegio Romano. Il padre, però, non permise che terminasse il corso di studi, «sotto pretesto di condurlo a Fiorenza per curarlo di una grave oftalmia», come ci riporta, non senza insinuazioni, l'abate vallombrosano Diego Franchi. Era il 1578. Nel 1580 Galileo tornò nuovamente a Pisa, per immatricolarsi all'Università come artista, cioè studente in medicina e filosofia, vivendo sempre sotto l'ala protettiva di Muzio Tedaldi, nella cui casa era ospite.