Filippo Brunelleschi fu il progettista della più straordinaria impresa architettonica rinascimentale, la Cupola di Santa Maria del Fiore a Firenze. Costruita tra il 1420 e il 1436 (lanterna esclusa), fu realizzata senza centine per sostenere la muratura; si calcola che vi furono impiegati oltre quattro milioni di mattoni. A Brunelleschi si deve anche l'invenzione della prospettiva lineare, su cui si fondava la nuova scienza dell'arte destinata a rivoluzionare la cultura figurativa. Masaccio, nella Trinità di Santa Maria Novella, realizzò uno dei primi e più convincenti documenti dell'applicazione delle nuove teorie brunelleschiane.

A Siena, Mariano di Iacopo, detto il Taccola, e Francesco di Giorgio eseguirono numerosi disegni di macchine civili e militari che rivelavano una sapiente ricerca tecnologica. Il Taccola, che si definiva l'"Archimede di Siena", in significativo omaggio alla scienza degli antichi, ha lasciato i quattro libri De ingeneis e il De machinis. Vi sono descritti progetti idraulici, elevatori d'acqua, tecniche di misurazione, macchine civili e da guerra. Ancora più ricca la quantità di disegni lasciata da Francesco di Giorgio, architetto, pittore, scultore e miniatore valentissimo. Francesco di Giorgio, che fu anche operaio dei Bottini di Siena, progettò tecniche per camminare sull'acqua o navigare, disegnò fontane a sorpresa, macchine da guerra, alzacolonne, argani e gru, carri e mulini. La sua opera testimoniava la vivacità di una cultura tecnico-scientifica che sapeva immaginare, anticipando le intuizioni leonardiane, il volo o l'atterraggio con il paracadute.

Fu Leonardo da Vinci a indagare ogni ramo del sapere: dall'anatomia alla botanica, all'idraulica, alla meccanica, alla geometria, alla fisica, alle scienze militari, ai misteri del volo, alla fisiognomica, fino ai semplici rebus per allenare la mente. Per lui, solo l'occhio dell'artista era in grado di investigare, interpretare e svelare il mondo naturale. La figura di Leonardo, per cui la pittura era la scienza per eccellenza, è stata unica e irripetibile, testimoniando quanto il rapporto tra arte e scienza rappresentasse uno dei nodi fondamentali della cultura del Rinascimento.

Con la Lezione nella quale si disputava della maggioranza delle arti, recitata all'Accademia Fiorentina nel 1547, l'erudito Benedetto Varchi sottolineò l'importanza della pittura per le scienze anatomiche, astronomiche, botaniche e zoologiche. Nella trattatistica d'arte tra Quattrocento e Cinquecento, precisi erano i collegamenti tra le arti e lo studio del corpo umano. Da Leon Battista Alberti, a Giorgio Vasari, ad Alessandro Allori, il disegno e la pratica anatomica erano indicati come momenti imprescindibili per la formazione dell'artista. Dissezioni di cadaveri furono condotte da Leonardo nell'ospedale di Santa Maria Novella. Anche l'Accademia fiorentina delle Arti del Disegno prevedeva pubbliche dissezioni. Il medico fiorentino Guido Guidi affidò a Francesco Salviati il compito di illustrare la Raccolta di chirurgi greci, mentre sul finire del Cinquecento il pittore Ludovico Cardi, detto il Cigoli, strinse amicizia con l'anatomista francese Théodore De Mayern, di passaggio a Firenze. Documento del rapporto tra l'artista e il medico francese è lo Scorticato, statuetta in bronzo, oggi al Museo Nazionale del Bargello, eseguita dal Cigoli sulla base di precise conoscenze anatomiche.

L'Accademia fiorentina delle Arti del Disegno prevedeva anche l'insegnamento della geometria euclidea e della matematica. Molti furono i pittori affascinati dall'astronomia. Il Cigoli, grande amico di Galileo Galilei, fu impressionato dalle immagini della Luna inserite dallo scienziato pisano nel Sidereus Nuncius del 1610. La Vergine dell'Immacolata Concezione affrescata nella Cappella Paolina a Roma era la prima raffigurazione che un pittore offriva della luna galileiana, non più liscia ma dalla superficie scabra, come se fosse osservata con un telescopio. Nel 1613 Galileo fu nominato membro dell'Accademia fiorentina delle Arti del Disegno.

Grande fu la passione della famiglia de' Medici per l'illustrazione naturalistica. Francesco Bachiacca, che Vasari ricordava come «ottimo pittore nel ritrarre tutte le sorti di animali», eseguì per Cosimo I «uno scrittoio tutto pieno d'uccelli di diverse maniere e d'erbe rare». La stanza delle carte geografiche nella Guardaroba di Palazzo Vecchio, commissionata da Cosimo a Egnazio Danti, prevedeva le carte di tutti i paesi conosciuti e sotto di esse, come riferiva Vasari, "«tutte l'erbe e tutti gli animali ritratti al naturale secondo la qualità che producono que' paesi».

Nel Giardino dei Semplici pisano era attiva una bottega artistica in grado di accompagnare con raffinate tempere le ricerche condotte dai "prefetti" Andrea Cesalpino, Giuseppe Casabona, Francesco Malocchi. Tra gli artisti impegnati nel raffigurare piante o animali, vi erano il tedesco Daniel Froeschl e il pistoiese Filippo Paladini. Per il Granduca Francesco I lavorava il pittore veronese Jacopo Ligozzi. Davanti alle sue tempere di piante, uccelli e pesci la meraviglia degli scienziati fu grande: il naturalista bolognese Ulisse Aldrovandi, a Firenze nel 1577 su invito del Granduca, scrisse che alle pitture di Ligozzi «non mancha se non il spirito». Le immagini di piante, animali, ma anche di bicchieri e costumi turcheschi, eseguite da Ligozzi e conservate nel Gabinetto Disegni e Stampe degli Uffizi, costituiscono la più alta testimonianza delle straordinarie possibilità dell'illustrazione naturalistica.

Per Francesco I, il principe dello Studiolo dai forti interessi scientifici e magico-alchemici, lavorarono molti artisti, tra cui Bernardo Buontalenti. Suoi i progetti di Pratolino, con i giochi d'acqua e gli automi, della Tribuna degli Uffizi e del Casino di San Marco. Nel Casino di San Marco si fondeva il cristallo di montagna, si producevano porcellane, vetri, oggetti di oreficeria e cristalli. Momento significativo nel rapporto fra arte e scienza fu la costituzione dell'Opificio delle Pietre Dure, che si occupò della decorazione della cappella dei Principi in San Lorenzo.

In ogni ramo del sapere, come indica proprio lo Studiolo del Principe, arte e scienza si unirono in perfetta armonia. Girolamo della Volpaia, nipote di quel Lorenzo della Volpaia che aveva costruito il celebre orologio dei pianeti per Lorenzo il Magnifico, costruì splendide sfere armillari, ingegnosi orologi e quadranti. Autentico capolavoro è la grande sfera armillare di Antonio Santucci, iniziata il 4 marzo 1588 e terminata il 6 maggio 1593, oggi conservata all'Istituto e Museo di Storia della Scienza di Firenze.

Nella prima metà del Seicento, giunsero a Firenze artisti in grado di determinare importanti sviluppi al genere della natura morta e dell'illustrazione naturalistica: su tutti, Filippo Napoletano e Giovanna Gazzoni. Sul finire del secolo arrivò alla corte granducale il ceroplasta siciliano Gaetano Zumbo. In contatto con Francesco Redi, eseguì non solo splendidi preparati anatomici, ma anche scenografiche composizioni che destarono la meraviglia di medici e scienziati.

Per le ville di Careggi, dell'Ambrogiana e di Castello, il Granduca Cosimo III commissionò a Bartolomeo Bimbi e Andrea Scacciati grandi tele raffiguranti i frutti, i fiori, gli agrumi nati nei giardini medicei, e gli animali custoditi nei serragli di corte. Zucche mostruose, aranci giganteschi, splendidi uccelli esotici, ma anche precisi campionari ortofrutticoli, oggi nel Museo Botanico fiorentino, erano strettamente collegati alle ricerche botaniche di Pier Antonio Micheli. Nel corso del Settecento, videro la luce alcune prestigiose imprese editoriali. Tra le più belle, la Storia naturale degli Uccelli di Saverio Manetti, stampata tra il 1767 e il 1776, con le eleganti tavole eseguite da Violante Vanni e Lorenzo Lorenzi. Gli originali, già nel Museo pisano di Storia Naturale, sono oggi conservati nella Biblioteca Universitaria di Pisa.

Alla fine del Settecento era ancora viva la tradizione dei ceroplasti fiorentini. Nel 1782 Clemente Susini, coadiuvato da Giuseppe Ferroni, eseguì per il Museo di Fisica e Storia Naturale una suggestiva Venere scomponibile. La tradizione continuò nell'Ottocento grazie all'allievo di Susini, Francesco Calenzuoli, e al chimico autodidatta Luigi Calamai: i loro preparati anatomici e botanici vennero realizzati sotto la guida degli scienziati più autorevoli, come ad esempio Giovanni Battista Amici che guidò Calamai nella realizzazione di esemplari particolarmente complessi.

Si deve a Paolo Mascagni la più bella opera anatomica ottocentesca: nel 1823, sette anni dopo la sua morte, uscì a Pisa la Anatomia universa, monumentale lavoro a cui lo scienziato si era dedicato per anni. Le superbe tavole furono realizzate da Antonio Serantoni. Abile illustratore naturalistico, Serantoni realizzò le tavole per la Flora Italiana di Gaetano Savi, pubblicata a Pisa tra il 1818 e il 1824, e per la Pomona Italiana di Giorgio Gallesio, opera tra le più belle della letteratura orticola europea. Da segnalare, per la bellezza dell'apparato iconografico, anche la Raccolta di fiori, frutti e agrumi di Antonio Targioni Tozzetti, stampata a Firenze nel 1825, e l'Antotrofia, ossia la coltivazione dei fiori, pubblicata nel 1834 da Antonio Piccioli, giardiniere del Museo di Fisica e Storia Naturale di Firenze. Negli stessi anni, nel Museo pisano di storia naturale Paolo Savi eseguiva alcuni gruppi di animali imbalsamati che furono giudicati dagli scienziati di tutto il mondo insuperabili opere d'arte.

Nel 1841, in occasione del terzo Congresso degli Scienziati Italiani, fu costruita, su progetto dall'architetto fiorentino Giuseppe Martelli, la Tribuna di Galileo. Monumento unico nel suo genere, l'edificio fu concepito come sintesi iconografica della scienza sperimentale. Un ricco apparato iconografico, infatti, raffigura gli strumenti, le scoperte scientifiche e gli scienziati che le resero possibili.